D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Fytopathogenic sveppurinn Colletotrichum coccodes veldur hættulegum sjúkdómum í kartöflum og tómötum sem kallast anthracnose og tuber svartur blettur. Með formgerðareinkennum er oft erfitt að greina þá frá sjúkdómum af völdum annarra örvera; á grænum tómatávöxtum getur sjúkdómurinn verið einkennalaus og birtist aðeins á þroskuðum rauðum ávöxtum. Til að fá skjóta og nákvæma greiningu á sýkla er boðið upp á PCR prófunarkerfi í rauntíma. Til að þróa prófunarkerfi var ákvarðað núkleótíð röð glýseróltrifosfat dehýdrógenasa gena 45 C. coccodes stofnar einangraðir úr kartöfluhnýði á mismunandi svæðum í Rússlandi.
Byggt á niðurstöðum sem fengust og greiningu á svipuðum raðir annarra tegunda sem fáanlegar eru í GenBank gagnagrunninum voru tegundasértækar grunnur og rannsakandi fyrir C. coccodes hannaðar. Til að prófa sérstöðu búna prófakerfisins var PCR framkvæmt með DNA einangrað úr hreinum ræktun 15 mismunandi tegunda sníkjudýra- og saprotrophic sveppa sem tengdust tómatar og kartöfluplöntum (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Tilvist Colletotrichum coccodes DNA var ákvörðuð við þröskuldsferil 20-27 en aðrar tegundir greindust eftir 40 lotur eða greindust ekki. Prófunarkerfið gerir það mögulegt að greina áreiðanlegan styrk C. coccodes DNA umfram 0.01 ng / mm3 í greindu PCR blöndunni. Með því að nota þróaða prófunarkerfið var tilvist C. coccodes í tómatlaufum með einkennum sveppasjúkdóma og í kartöfluhnýði án ytri einkenna sjúkdómsins. Laufum með einkennum sveppasýkingar var safnað frá tveimur mismunandi sviðum í Krasnodar-svæðinu, hnýði - frá akrum í Kostroma, Moskvu, Kaluga, Nizhny Novgorod svæðunum. Eitt tómatblað sem innihélt C. coccodes DNA fannst í Krasnodar Territory; veruleg tilvist DNA þessa sýkla greindist í 5 sýnum af hnýði sem ræktuð voru í Kostroma, Moskvu, Kaluga svæðinu.
Inngangur
Sveppir af ættkvíslinni Colletotrichum eru hættulegir plöntuæxli sem hafa áhrif á korn, grænmeti, kryddjurtir, fjölær ávexti og berjaplöntur. Ein af alls staðar nálægum tegundum þessarar ættkvíslar, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes, er orsakavaldur antracnose og svartur blettur af kartöflum og tómötum og veldur sjúkdómum í fjölda annarra plantna af Solanaceae fjölskyldunni, þ.m.t. illgresi (Dillard, 1992). C. coccodes smitar alla neðanjarðarhluta plöntunnar, stofnfrumur, lauf og ávexti (Andrivon o.fl., 1998; Johnson, 1994). Á hýði smitaðra kartöfluhnýða sést þróun grára bletta með ógreinilega áberandi brúnir, þar sem svartir punktar sporólu og smásjá eru greinilega sýnilegir. Við geymslu geta sár með mýkt innihald myndast í kvoða hnýði, þ.e. sjúkdómurinn fer inn í anthracnose fasa, sem er þó afar sjaldgæfur.
Á sama tíma eru einkenni antraknósu (húðsár með litlum svörtum punktum) dæmigerð fyrir tómatávöxt. Á laufum birtast einkenni C. coccodes sem dökkbrúnir blettir, venjulega afmarkaðir af gulum vefjum (Johnson, 1994).
Þróun svarta blettar á hnýði spillir útliti þeirra, sem er sérstaklega áberandi þegar selt eru þvegnar rauðhýddar kartöflur. Afhýddun á hýði leiðir til umfram uppgufunar og aukins geymslutaps (Hunger og McIntyre, 1979). Skemmdir á öðrum líffærum plantna leiða til afraksturs, sem kom fram bæði á opnum og lokuðum jörðu (Johnson, 1994; Tsror o.fl., 1999). Sjúkdómar af völdum C. coccodes eru algengir í næstum öllum kartöflumyndandi svæðum heims, þar á meðal í Rússlandi (Leesa, Hilton, 2003; Belov o.fl., 2018). Stjórnun þessara sjúkdóma er erfið vegna ófullnægjandi virkni núverandi sveppalyfja gegn C. coccodes og skorti á ónæmum afbrigðum (Read, Hide, 1995).
Inoculum C. coccodes getur varað í fræhnýrum (Read, Hide, 1988; Johnson o.fl., 1997), tómatfræjum (Ben-Daniel o.fl., 2010), lifað lengi í jarðvegi, á plöntusorpi (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) og í illgresi (Raid, Pennypacker, 1987). Verk fjölda höfunda (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson o.fl., 1997; Dillard, Cobb, 1993) hafa sýnt að þróun sjúkdómsins í kartöflum og tómötum veltur að miklu leyti á tilvist inoculum í fræi og mold. Þess vegna, til að lágmarka tjón af völdum sjúkdómsins, er nauðsynlegt að greina (þar með talið magn) fjölgun sveppsins í fræefninu, í jarðveginum, í fræ kartöfluhnýði og tómatfræjum sem lagt er til geymslu. Formgerðargreining í jarðvegi og plöntuefni er aðeins hægt að framkvæma með nærveru smásjá, sem þó er einnig að finna í öðrum tegundum sveppa.
Einkennin á hnýði eru mjög svipuð og silfurlitaða hrúður af völdum sveppsins Helminthosporium solani. Einangrun Colletotrichum coccodes og Helminthosporium solani í hreina ræktun er frekar erfið og tekur langan tíma vegna hægs vaxtar á næringarefnum. Til að bera kennsl á Colletotrichum kóða er fljótt nauðsynlegt að nota greiningaraðferðir við tæki. Þægilegasta aðferðin er pólýmerasa keðjuverkun (PCR) og breyting hennar - rauntíma PCR. Sem stendur er prófunarkerfi þróað af breskum vísindamönnum (Cullen o.fl., 2002) fyrir ITS1 svæðið í rDNA notað í Evrópu og Bandaríkjunum. Notkun þess hefur sýnt góðan árangur við greiningu á rússneskum einangrum (Belov o.fl., 2018). Hins vegar eru C. coccodes mjög breytilegir og greining þess frá einni DNA röð getur leitt til rangra neikvæðra niðurstaðna. Til að fá áreiðanlegri greiningu er nauðsynlegt að greina nokkrar tegundar sértækar DNA röð, í tengslum við það höfum við þróað frumprófakerfi sem gerir okkur kleift að bera kennsl á C. coccodes með röð glýseraldehýð-3-fosfat dehýdrógenasa geninu.
efni og aðferðir
Til að meta skilvirkni og sérstöðu búna prófunarkerfanna notuðum við hreinar ræktanir af 15 tegundum sveppa sem einangraðir voru af höfundum úr sýnum sýnum af tómatblöðum og ávöxtum, kartöfluhnýði (tafla 1). Til einangrunar voru líffæri plantna með einkenni um sveppasýkingu tekin, ekki meira en eitt líffæri í hverja runna.
Sneið af hnýði með hýði, sneið af tómatávöxtum og áhrifum lauf var sett undir sjónaukar smásjá, en að því loknu voru mycelium, gró eða stykki af vefjum flutt yfir í agar miðil (jurtagar) í petrískál með beittri nál. Einangrunarefnin voru geymd á agarhalla í tilraunaglösum við 4 ° C.
Sýni af tómatblöðum með einkennum sveppasjúkdóma sem ætluð voru til greiningar strax eftir söfnun (á akrinum) var sett í 70% etýlalkóhól þar sem þau voru geymd þar til DNA einangrun. Kartöfluhnýði var afhent á rannsóknarstofunni, afhýdd (2 × 1 cm stykki) af þeim og fryst við -20 ° С. Geymt frosið þar til DNA einangrun.
Hrein ræktun sveppa til DNA einangrunar var ræktuð í fljótandi ertimiðli. Sveppasvampurinn var fjarlægður úr fljótandi miðlinum, þurrkaður á síupappír, frystur í fljótandi köfnunarefni, einsleitur, ræktaður í CTAB biðminni, hreinsaður með klóróformi, felldur með blöndu af ísóprópanóli og 0.5 M kalíumasetati, þveginn tvisvar með 2% alkóhóli. DNA sem myndaðist var leyst upp í afjónað vatni og geymt við -70 ° C (Kutuzova o.fl., 20). DNA styrkur var mældur með HS DNA magnmælingarbúnaði fyrir tvöfalt strandað DNA á Qubit 2017 (Qiagen, Þýskalandi). Alkóhóliseruðu og frosnu sýnin voru trítruð í fljótandi köfnunarefni, síðan var DNA útdráttur gerður eins og lýst er hér að ofan (fyrir mycelium hreinna sveppiræktana).
Tafla 1. Uppruni notaða sveppastofnanna
Sveppanafn | Planta, líffæri | Valstaður |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | kartöfluhnýði | Kostroma hérað, kartöfluhnýði af 1. akrarkynslóðinni, ræktun Red Scarlett |
Colletotrichum coccodes 4 | kartöflublað | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | kartöfluhnýði | Magadan hérað, pos. Tjald, kartöfluhnýði |
Cladosporium fulvum | tómatblað | Moskvu hérað, stórávaxta tómatur |
Alternaria tomatophila | tómatávöxtur | lögð fram af starfsfólki rannsóknarstofu í mycology og phytopathology á All-Russian Research Institute of Plant Protection |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tómatávöxtur | Krasnodar Territory, Krymsky-hverfi, einkunn Cream |
Fusarium oxysporum | hveiti rót | Moskvu héraðið |
PCR var framkvæmt á DTprime magnara (DNA-tækni). Fyrir PCR voru upprunalegar grunnur og rannsakandi fyrir tegundasértækt svæði glýseróltrifosfat dehýdrógenasa gensins notað: áfram grunnur Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, öfugur grunnur Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1, rannsaka Grunnarnir magna upp 213 bp svæði.
Viðbrögðin tóku 50 ng af heildar DNA (við greiningu á laufum og hnýði) og 10 ng (við greiningu á DNA af hreinum svepparræktum). Hvarfblandan (35 μl) var aðskilin með paraffínlagi í tvo hluta: sá neðri (20 μl) innihélt 2 μl af 10 × hvarfabuffer (750 mM Tris-HCI, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM af hverju deoxínukleótíð trifosfati, 7 pmól af hverri grunn og 4 pmól af vatnsrofanlegu flúrljómandi rannsaka; sú efri innihélt 1 μl af 10 × PCR biðminni og 1 U af Taq pólýmerasa.
Aðskilnaður blöndunnar með paraffíni gerir kleift að geyma rörin í langan tíma við hitastig 5 ° C og veita PCR heitt upphaf eftir upphitun þeirra í 10 mínútur við hitastig yfir 80 ° C. PCR var framkvæmd samkvæmt eftirfarandi forriti: 94.0 ° C - 90 s (1 lota); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 lotur); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 lotur); 10.0 ° C - geymsla.
Niðurstöður og umræður
Raðir glýseróltrifosfat dehýdrógenasa gensins voru ákvarðaðir í 45 stofnum einangraðir úr laufum, stilkur, kartöfluhnýði og tómatávöxtum (Kutuzova, 2018) á mismunandi svæðum í Rússlandi. Rannsóknirnar á öllum stofnum var skipt í tvo hópa sem voru mismunandi í tveimur núkleótíðum. Núkleótíðröð fulltrúa beggja hópa undir númerunum KY2 og KY496634 hefur verið afhent í GenBank.
Primers coc70gdf, coc280gdr og cocgdz rannsakinn sem hannaður var á grundvelli þeirra voru athugaðir með BLAST forritinu (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) um allar raðir glýseróltrifosfat dehýdrógenasa gena af tegundum af ættkvíslinni Colletotrichum og öðrum lífverum sem fáanlegar eru í GenBank gagnagrunninum.
Engin DNA svæði annarra lífvera fundust mjög einsleit og frumur.
Næmi prófunarkerfisins var athugað með því að nota sýni með mismunandi styrk C. coccodes DNA, DNA kartöflu laufs smitað af anthracnose (safnað árið 2017 í Mari El, fjölbreytni Red Scarlett) og afhýða hnýði sem hafa áhrif á svartan blett (safnað í Kostroma svæðinu, fjölbreytni Red Scarlett, tafla 2). Til að staðfesta tilvist DNA í hnýði og kartöflu laufum voru C. coccodes stofnar einangraðir frá þeim í hreina ræktun.
Niðurstöður næmisgreiningar prófunarkerfisins sýna að hægt er að nota það til að greina nærveru C. coccodes DNA í sýni þegar heildarinnihald þess í PCR blöndunni er meira en 0.05 ng. Þetta er alveg nægilegt til greiningar, þar sem einn sclerotia inniheldur að meðaltali 0.131 ng og ein gró inniheldur um 0.04 ng af DNA (Cullen o.fl., 2002). Prófakerfið sem breska hópurinn þróaði (Cullen o.fl., 2002) sýndi svipaða næmni (þröskuldsferill 34 við 0.05 ng DNA og 37 við 0.005 ng).
Greining á náttúrulegum sýnum sem innihéldu C. coccodes í öllum tilvikum gerði það mögulegt að sýna áreiðanlegan hátt í sýninu (tafla 2). Fyrirhuguð aðferð við DNA einangrun átti einnig við greiningu á náttúrulegum plöntusýnum.
Tafla 2. Ákvörðun á næmi fyrirhugaðs prófunarkerfis til að bera kennsl á Colletotrichum kóða fyrir rauntíma PCR
Dæmi | DNA magn í sýni *, ng | Þröskuldsferill | C. krabbameinsgreining |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Tuber afhýða 1 | 50 | 32 | + |
Tuber afhýða 2 | 50 | 30 | + |
Tuber afhýða 3 | 50 | 31.5 | + |
Kartöflublað | 50 | 29.5 | + |
Athugið. * Í blöndu af PCR vörum.
Sértækni prófunarkerfisins var prófuð á DNA sýnum sem unnar voru úr 15 tegundum sveppa. Allir sveppastofnar voru einangraðir af höfundum frá áhrifum og heilbrigðum ávöxtum og laufum tómatar, kartöfluhnýði; einn stofn var einangraður frá hveitirót (tafla 1). Meðal tegunda sem eru einangruð frá yfirborði ávaxtanna eru einnig tegundir sem eru ekki sjúkdómsvaldandi fyrir tómata (til dæmis Phellinus ferrugineovelutinus).
Rannsóknir hafa sýnt að C. coccodes DNA greindist við þröskuldsferil 20-27 en aðrar sveppategundir greindust ekki eða gáfu merki eftir hring 40, sem má rekja til ósértækra hávaðaáhrifa (tafla 3).
Tafla 3. Prófun á prófunarkerfi fyrir ýmsar tegundir sveppa
Sveppanafn | Þröskuldsferill |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. kóða 2 | 22.6 |
C. kóða 3 | 23 |
C. kóða 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia Solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tómatófíla | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium SP. | > 40 |
Athugið. * Magn DNA í öllum sýnum var 10 ng.
Þróaða prófunarkerfið var notað til að bera kennsl á C. coccodes í laufsýnum úr tómötum með einkennum drepandi sýkla og fræ kartöfluhnýði án sýnilegra einkenna. Fyrir rannsóknina tókum við fræhnýði af mismunandi stofnum sem ræktaðir voru í Kostroma, Moskvu, Kaluga, Nizhny Novgorod svæðunum. Tilvist C. coccodes DNA var talin marktæk í sýnunum, við greiningu þar sem þröskuldsferill fór ekki yfir 35. Þetta þröskuldsgildi var valið út frá áreiðanlegri ákvörðun 0.05 ng af C. coccodes DNA (þröskuldslot 33.5, tafla 2) og þeirri staðreynd að þröskuldslotur yfir 40, greindist ósértækt DNA af einhverjum öðrum tegundum sveppa. Með þessari nálgun greindist veruleg tilvist C. coccodes DNA í 5 sýnum af hnýði sem ræktuð voru í Kostroma, Moskvu, Kaluga svæðinu og í einu tómatblaði frá Yeisk héraði í Krasnodar héraði (Töflur 4, 5).
Tafla 4. Uppgötvun Colletotrichum kókkóða á kartöflumótum *
Dæmi um númer | Fjölbreytni kartöflum | Vöxtur | C. krabbameinsgreining | Þröskuldsferill |
---|---|---|---|---|
1 | Rauður skarlati | Kostroma hérað | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskvu héraðið | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky snemma | Moskvu héraðið | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga hérað | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Ímyndunarafl | Kaluga hérað | - | |
15 | Gala | Nizhny Novgorod svæðinu. | - | |
16 | - |
Athugið. * Magn DNA í öllum sýnum var 50 ng.
Tafla 5. Uppgötvun Colletotrichum coccodes á tómatlaufum *
Dæmi um númer | Vöxtur | C. krabbameinsgreining | Þröskuldsferill |
---|---|---|---|
1 | Krasnodar-svæðið, Krímumdæmið | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodar Territory, Yeisk District | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Magn DNA í öllum sýnum var 50 ng.
Prófakerfið sem við höfum búið til er ekki síðra en það sem breskir vísindamenn þróuðu (Cullen o.fl., 2002) varðandi næmi og sérstöðu og hentar vel til greiningar á plöntusýnum. Umsókn þess til greiningar á fræhnýrum gerði það mögulegt að bera kennsl á C. coccodes DNA í hnýði án ytri merkja um skemmdir og greina smit laufs með góðum árangri.
Hingað til hefur ekki verið gerð nein greining á kartöfluhnýði til sýkingar á C. coccodes í Rússlandi. Fyrsta rannsókn okkar sýndi að af 16 prófuðum fræhnýðum sem ræktaðir voru á mismunandi svæðum í Rússlandi, innihalda 5 C. kókskóða. Þetta sýnir að svartur blettur af kartöfluhnýði er algengur kartöflusjúkdómur í Rússlandi og hlutverk hans við að draga úr magni og gæðum kartöfluuppskerunnar er vanmetið.
Greining á tómatblöðum leiddi í ljós verulega tilvist C. coccodes DNA í einu laufi frá Yeisk-hverfi Krasnodar-svæðisins. Fyrr, þegar tómatakrar í Suður-Rússlandi voru skoðaðir með breska prófunarkerfinu (Cullen o.fl., 2002), fundust laufblöð sem innihéldu C. coccodes og á sumum sviðum fannst hátt hlutfall laufa sem voru smitaðir af C. coccodes (Belov o.fl., 2018). Á Krasnodar og Primorsky svæðinu, Moskvu svæðinu, fundum við tómataávexti, þaðan sem við náðum að einangra hreina menningu C. coccodes. Hugsanlegt er að C. coccodes sé mun útbreiddari á tómötum í Rússlandi en nú er talið og skaðsemi þess er einnig vanmetin.
Þannig hafa hingað til safnast nægar upplýsingar um mikla dreifingu C. kókósa á kartöflum og tómötum.
Til að skilja betur hlutverk þessa svepps við þróun kartöflu- og tómatsjúkdóma er nauðsynlegt að fylgjast með algengi hans í Rússlandi, kanna hlutverk jarðvegs- og fræjasýkinga og hlutverk svarta blettanna í tapi við geymslu. Notkun PCR greiningar getur auðveldað þessa vinnu verulega og samtímis notkun beggja prófunarkerfanna mun auka nákvæmni greiningarinnar verulega.
Þessi vinna var studd af styrk rússnesku vísindastofnunarinnar nr 18-76-00009.
Greinin var birt í tímaritinu „Mycology and Phytopathology“ (54. bindi, nr. 1, 2020).