Borða. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky
Nýlega hefur verið sýnt fram á að ascomycete sveppurinn Ilyonectria crassa er fær um að smita kartöfluhnýði. Þessi vinna er sú fyrsta sem greinir líffræðilega eiginleika og viðnám gegn sumum sveppadrepum í I. crassa stofni sem er einangraður úr kartöflum. Raðir tegundasértækra svæða „kartöflu“ stofnsins féllu saman við þær sem fengnar voru fyrir sveppi sem voru einangraðir frá rótum nafla, ginseng, asp og beyki, liljuperum og túlípanalaufum. Eins og gefur að skilja geta margar villtar plöntur og garðplöntur verið forði I. crassa. Rannsakaði stofninn smitaði tómata og kartöflusneiðar en smitaði ekki allan tómatávöxtinn og ósnortinn kartöfluhnýði. Þetta sýnir að I. crassa er sárasníkjudýr. Mat á ónæmi gegn flúdioxóníli, dífenókónazóli og azoxýstróbíni á næringarefnum sýndi mikla virkni þessara lyfja.
EC50 vísirinn (styrkur sveppalyfsins, sem hægir á tvöföldu geislavöxtum nýlendunnar miðað við ekki sveppalyfjameðferðina) var jafn 2; 0.4 og 7.4 mg / l. Taka skal tillit til möguleikans á þróun sjúkdómsins af völdum I. crassa þegar plöntufræðilegt mat á kartöfluhnýði og þróun plöntuverndarráðstafana er þróað.
Þróun fytopathogenic örvera leiðir til mikils taps á öllum stigum ræktunar og geymslu kartöflum. Við skipulagningu verndarráðstafana er að jafnaði tekið tillit til þekktra sýkla, svo sem tegundir af ættkvíslunum Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora o.s.frv. En á síðustu árum hafa fleiri og fleiri skýrslur birst um útlit nýrra fitusjúkdómsvaldandi örvera á kartöflum. Líffræði þeirra er illa rannsakað, virkni sveppalyfja sem notuð eru á kartöflur gagnvart þeim er óþekkt, greiningaraðferðir hafa ekki verið þróaðar. Með massaþróun geta þeir valdið verulegu tjóni á kartöfluuppskerunni. Ein þessara örvera er ascomycete sveppurinn Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, sem höfundar uppgötvuðu fyrst á kartöfluhnýði (Chudinova o.fl., 2019).
Þessi vinna kynnir niðurstöður greiningar á I. crassa stofni sem er einangraður úr kartöfluhnýði. Formgerð nýlendna og mycelial uppbyggingar I. crassa, núkleótíðraðir tegundasértækra DNA svæða, veiru við kartöflum og tómötum og ónæmi fyrir nokkrum vinsælum sveppum var rannsökuð.
efni og aðferðir
Við notuðum I. crassa 18KSuPT2 stofninn sem var einangraður árið 2018 frá viðkomandi kartöfluhnýði sem ræktaður er í Kostroma svæðinu. Hnýði var fyrir áhrifum af þurrum rotna gerð með holrúmi þakið ljósbrúnu mycelium. Með því að nota dauðhreinsaða nál, var sveppasykurinn fluttur í Petri fat með agar miðli (bjórvörtur 10%, agar 1.5%, pensilín 1000 U / ml). Plöturnar voru ræktaðar í myrkri við 24 ° C.
Leica DM2500 ljóssmásjá með ICC50 HD stafrænni myndavél og Leica M80 sjónauka smásjá með IC80HD stafrænni myndavél (Leica Microsystems, Þýskalandi) voru notaðar til að mynda, meta stærð og formgerð gróa og líffæra.
Til að einangra DNA var sveppamycelið ræktað í fljótandi ertimiðli, síðan fryst í fljótandi köfnunarefni, einsleitt, ræktað í CTAB biðminni, hreinsað með klóróformi og þvegið tvisvar með 2% áfengi.
DNA útdráttaraðferðinni er lýst nákvæmlega í grein Kutuzova o.fl. (2017).
Til að ákvarða tegundina með sameindaaðferðum og bera saman við aðra þekkta I. crassa stofna var PCR framkvæmd með grunnum sem leyfðu mögnun á tegundasértækum DNA svæðum: ITS1-5,8S-ITS2 (grunnur ITS5 / ITS4, White o.fl., 1990), genasvæði b -túbúlín (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) og þýðing lengingarstuðull 1α (tef1α) (grunnur EF1-728F / EF1-986R, Carbone og Kohn, 1999). Líkamsræktarmenn af æskilegri lengd voru dregnir úr hlaupinu með Evrogen CleanUp búnaðinum. Mögnuðu svæðin voru raðgreind með BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) á Applied Biosystems 3730 xl sjálfvirkum sequencer (Applied Biosystems, CA, Bandaríkjunum). Þær núkleótíðraðir sem fengust voru notaðar til að leita að samsvörun í GenBank gagnagrunni bandarísku upplýsingamiðstöðvarinnar um líftækni (NCBI). Fylogenetic greining var gerð með MEGA 6 forritinu (Tamura o.fl., 2013).
Ákvörðun um meinsemd var framkvæmd á heilum grænum ávöxtum stórávaxta tómatar (fjölbreytni Dubrava) og kartöfluhnýði (fjölbreytni Gala). Að auki, til að líkja eftir skemmdum á skemmdum ávöxtum og hnýði, notuðum við sneiðar af sömu ávöxtum og hnýði. Sneiðar af hnýði voru settar í raka hólf, sem voru petri diskar með blautum síupappír neðst. Rennibraut var sett á pappírinn sem aftur var settur hnýði eða ávextir. Heilu hnýði og ávöxtum var einnig komið fyrir í ílátum með blautum síupappír neðst. Í miðju sneiðarinnar (eða á ósnortnu yfirborði hnýði eða ávaxta) var agarstykki (5 × 5 mm) með sveppalyfjum komið fyrir eftir 5 daga ræktun á jurtagar.
Mat á viðnámi sveppastofna við sveppum var framkvæmt við rannsóknarstofu á agar næringarefnum. Við rannsökuðum næmi fyrir sveppalyfjum Maxim, KS (virka efnið flúdioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (Ríkisskrá ..., 2020). Mat var framkvæmt í petrískálum á jurtagaramiðli með því að bæta við rannsökuðu lyfin í styrk virka efnisins 0.1; einn; 1 ppm (mg / L) (fyrir flúdioxonil og difenoconazol), 10; tíu; 1 ppm (fyrir azoxystrobin) og í fjölmiðlum án sveppalyfja (viðmiðunar). Sveppalyfinu var bætt við bráðnað og kælt í 10 ° C miðil, eftir það var miðlinum hellt í petrískál. Agarblokk með sveppamisli var sett í miðju petrískálar og ræktuð við 100 ° C hita í myrkri. Eftir 60 daga ræktun var þvermál nýlendnanna mæld í tveimur hvorum megin hornréttum; mælt var um niðurstöður mælinga fyrir hverja nýlendu. Tilraunirnar voru gerðar í tvíriti. Byggt á niðurstöðum greininganna var EC24 reiknað út, jafnt styrkur sveppalyfsins, sem helmingaði hraða geislavöxtar nýlendunnar miðað við sveppalyfjameðferð.
Niðurstöður og umræður
Á petríréttum með jurtagar myndaði sveppurinn nýlendur með hvítu flocculent mycelium. Miðillinn undir mycelíunni varð rauðbrúnn. Þegar miðillinn þornar myndaði sveppurinn gró af tveimur gerðum á stökum og samanlagðum þvagfórum í litlum sporódókíu. Makróconidia eru ílangir, sívalir, með einn til þrjá septa, meðallengd 27.2 µm með gildissvið 23.2 til 32.2 µm, breidd - allt að 4.9 µm (mynd 1). Meðal lengd míkróstækkana er 14.3 µm með gildissvið 10.3 til 18.1 µm, breiddin er allt að 4.0 µm. Allir stór- og örmyndunarstafir falla að breytileika tegundanna Ilyonectria crassa (Cabral o.fl., 2012).
Raðir tegundasértækra DNA svæða (ITS, b-tubulin, TEF 1α) féllu alveg saman við röð I. crassa stofna sem við rannsökuðum áðan (Chudinova o.fl., 2019, tafla 1). Í því skyni að rannsaka algengi I. crassa á öðrum svæðum og greina litróf áhrifa ræktana voru svipaðar DNA raðir í GenBank gagnagrunni greindar (tafla 1). Skörunin var 86 til 100%. Raðir allra þriggja DNA svæða „kartöflunnar“ I. crassa stofnsins voru eins og raðir stofnanna sem voru einangraðir úr liljuljósinu og narcissusrótunum í Hollandi og frá ginsengrótinni í Kanada. Við gátum ekki fundið aðra I. crassa stofna með þremur greindum hliðstæðum röðum í opnum gagnagrunnum. Hins vegar sýndi greining á afhentum ITS og b-tubulin röðum tilvist I. crassa á túlípanalaufum í Bretlandi. Sveppir með svipaða ITS röð voru auðkenndir við greiningu á mycobiota af aspum rótum í Kanada og beyki rótum á Ítalíu, kartöflu hnýði í Sádí Arabíu (tafla 1). Niðurstöður þessarar rannsóknar sýna að I. crassa dreifist á heimsvísu og geti smitað ýmsar plöntutegundir.
Þegar sjúkdómsvaldandi áhrif á sneiðar af tómötum og kartöflu voru ákvörðuð á 5. degi náði þvermál skemmdarinnar 1.5 cm. Stofnaðurinn sem rannsakað var smitaði ekki allan tómatávöxtinn og ósnortinn kartöfluhnýði. Tómatarnir höfðu hins vegar áhrif á kúplana. Til að útiloka möguleika á mengun var sveppaeinangrun úr mycelium sem þróaðist á kartöfluhnýtusneið einangruð í hreina ræktun. Það var alveg eins og foreldraálagið. Eins og gefur að skilja er I. crassa sárasníkjudýr.
Meðferð fyrir gróðursetningu á fræhnýrum með sveppum dregur úr þróun sjúkdóma á plöntum á vaxtarskeiðinu. Til að velja áhrifarík sveppalyf er mikilvægt að meta hver þeirra eru áhrifarík gegn I. сrassa. Verkið rannsakaði útbreidd virk efni sveppalyfja - flúdioxóníl, azoxystrobín, difenókónazól. Fludioxonil er með í nokkrum blöndum sem notaðar eru til að klæða fræ og fræhnýði áður en þær eru gróðursettar. Fludioxonil (Maxim) er einnig notað til að meðhöndla fræhnýði fyrir geymslu. Difenoconazole og azoxystrobin eru einnig með í fjölda efnablöndur sem notaðar eru til vinnslu fræefnis, svo og í efnablöndur sem ætlaðar eru til vinnslu gróðurplantna (State catalog ..., 2020).
Vöxtur I. crassa var rannsakaður á fjölmiðlum (mynd 2) með mismunandi styrk virkra efna: flúdioxóníl (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) og difenoconazol (EC50 = 7.4 ppm) (tafla 2). Þessar efnablöndur geta talist mjög árangursríkar gegn I. crassa, þar sem EC50 þeirra er marktækt lægri en ráðlagður styrkur efnablöndunnar í vinnuvökvanum sem notaðir eru við meðhöndlun hnýða. Samkvæmt ríkisskránni ... (2020) er styrkur flúdioxóníls í vökvanum til meðhöndlunar á kartöflumörum frá 500 til 1000 ppm, azoxystrobin (í vökvanum til meðhöndlunar á botni loðsins) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (í vökvanum til meðferðar á gróðurplöntum) - 187.5– 625 ppm.
Tafla 1. Líkleiki raða tegunda sértækra raða stofn 18KSuPT2 og stofna Ilyonectria crassa sem fáanlegir eru í Genbank gagnagrunninum
Stofn | Gestgjafaverksmiðja, útskilnaðarstaður | Raðnúmer sett inn í GenBank, hlutfall líkinda | Link | ||
Það er | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 og 18KSuPT2 | Kartöfluhnýði, Kostroma hérað | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova o.fl., 2019, þetta verk |
CBS 158/31 | Narcissus rætur, Holland | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral o.fl., 2012 |
CBS 139/30 | Lily pera, Holland | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ginseng rót, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | Túlípanablað, Bretlandi | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Asparrætur, Kanada | MT294410 100 | ND | ND | Ramsfield o.fl., 2020 |
ER1937 | Bók, Ítalía | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta. Bein skil |
KAUF19 | Kartöfluhnýði, Sádí Arabía | HE649390 98.3 | ND | ND | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = ekki afhent
Tafla 2. Viðnám Ilyonectria crassa við sveppalyfjum
(virkt efni) | EC50, ppm | ||||
3 dag | 5 dag | 7 dag | |||
Control | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (flúdioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (difenoconazole) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Í starfi okkar voru I. crassa stofnar einangraðir úr kartöfluhnýði í Kostroma og Moskvu (Chudinova o.fl., 2019) svæðin. Hátt hlutfall sveppastofna með ITS-röð eins og I. crassa kom í ljós þegar greindur var mycobiota kartöfluhnýða í Sádi-Arabíu (Gashgari og Gherbawy, 2013). Eins og gefur að skilja er I. crassa ekki eins sjaldgæft á kartöflum og það kann að virðast. Tilraunir okkar sýndu að sveppurinn gæti smitað skemmda tómataávexti. Það er vitað úr bókmenntunum að I. crassa er fær um að þroskast saprotrophically í jarðvegi (Moll o.fl., 2016), auk þess að smita ýmsar plöntur, jafnvel flokkunarfræðilega fjarlægar eins og áburðarásir, liljur, ginseng, asp og beyki (tafla 1). einn). Eins og gefur að skilja geta margar villtar plöntur og garðplöntur verið forði I. crassa. Ofangreint sýnir að þegar verið er að þróa verndarráðstafanir er nauðsynlegt að taka tillit til möguleikans á að hafa áhrif á kartöfluhnýði með þessum svepp. Víðtækar efnablöndur til meðferðar á kartöflumörum sem innihalda flúdioxónil, azoxystrobin og difenoconazol hafa sýnt mikla sveppalyfjameðferð gegn I. crassa.
Þessi vinna var studd af rússnesku stofnuninni um grunnrannsóknir (styrkur nr. 20-016-00139).
Greinin var birt í tímaritinu „Plöntuverndartíðindi“, 2020, 103 (3)